收到細(xì)胞后，首先觀察瓶身是否完好（注意有無(wú)縫隙，裂痕）；顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，有無(wú)細(xì)胞漂浮；用新潔爾滅消毒瓶口及瓶身；打開(kāi)瓶口，再次用新潔爾滅消毒瓶口（可能會(huì)有液體溢出，注意不要碰到液體），酒精燈烤瓶口消毒；將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至50ml離心管或廣口瓶中（若細(xì)胞漂浮嚴(yán)重，離心培養(yǎng)基，1000g*5分鐘，將離心后的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至另一個(gè)大離心管中，留一點(diǎn)吹打細(xì)胞沉淀成懸液，回收細(xì)胞至原培養(yǎng)瓶），若漂浮不嚴(yán)重，亦離心一下；在原培養(yǎng)瓶中留一部分原裝培養(yǎng)液，再補(bǔ)加自己新配的培養(yǎng)基至適當(dāng)容積，例如4ml，讓細(xì)胞適應(yīng)一下環(huán)境。 當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到70-80%，凍存大部分，小部分傳代。
關(guān)鍵操作規(guī)范：
復(fù)蘇流程：
快速解凍：37℃水浴中搖晃凍存管，5-10分鐘內(nèi)完成，加入4-6mL培養(yǎng)基離心去除DMSO37。
初始接種：細(xì)胞懸液置于T25瓶或6cm皿，24小時(shí)內(nèi)貼壁伸展，48小時(shí)換液。
日常維護(hù)：
換液頻率：每周2-3次，pH值穩(wěn)定在7.0-7.4。
污染防控：嚴(yán)格無(wú)菌操作，定期檢測(cè)支原體，使用雙抗預(yù)防細(xì)菌污染。
異常處理：
貼壁失敗：復(fù)蘇24小時(shí)未貼壁的細(xì)胞存活率下降30%-50%，需棄用。
消化成團(tuán)：吹打力度需輕柔均勻，避免機(jī)械損傷。
注意事項(xiàng)：
1)細(xì)胞漂浮：培養(yǎng)瓶不開(kāi)封，瓶口酒精擦拭后平躺放置在培養(yǎng)箱。次日觀察，如細(xì)胞大部分又貼回瓶底，表明細(xì)胞活力正常，剩余漂浮的細(xì)胞可以離心去掉，留10ml培養(yǎng)液培養(yǎng)觀察，細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度80%，進(jìn)行消化傳代；如細(xì)胞還是不貼壁，將細(xì)胞離心收集轉(zhuǎn)到新培養(yǎng)瓶，原培養(yǎng)瓶加部分培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，中間注意觀察，我們的技術(shù)人員會(huì)一直跟蹤指導(dǎo)，直到問(wèn)題解決。
2)對(duì)于生長(zhǎng)緩慢的貼壁細(xì)胞：可采用適當(dāng)?shù)奶岣吲囵B(yǎng)基中血清濃度，或隔日換液的方法來(lái)保證細(xì)胞的狀態(tài)和生長(zhǎng)速度。
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